在向各位科普腫瘤個性化用藥基因檢測期間，小編一直著重在向各位介紹與腫瘤有關的突變基因以及相關藥物，但是其實說到腫瘤個性化用藥基因檢測，究竟是使用什么儀器采用什么原理實現的？相信小伙伴們也是存在一定的疑問的。今天小編就來為大家解惑，帶來腫瘤基因檢測中應用最普遍的NGS技術（下一代測序技術/高通量測序技術）相關的科普。
NGS技術（下一代測序技術）：又稱高通量測序，以高輸出量和高解析度為主要特色，能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列讀取，在提供豐富的遺傳學信息的同時，還可大大降低測序費用、縮短測序時間的測序技術。
一直以來，出于欲望與好奇，人類在不斷研究關于生命的奧秘。在人類基因組計劃完成后，人們仍在研究如何提高測序效率，增加測序通量以及降低測序的費用。
以人類基因組為例：以前完成一個人類基因組的測序需要3年時間，而使用高通量測序技術，則僅需1周即可完成。最初人類基因組全測序需要花費1億美元，而在NGS出現后的2008年，一個100Gb數據量的人基因組只需幾十萬美元，降幅達99%。2015年，同樣一個100Gb數據量的人基因組只需花費1000美元左右，NGS使得基因測序變成了大多數人都可接受的技術。2008年開始，利用單個分子信號檢測的DNA測序技術相繼問世，這類DNA測序技術被稱為單分子測序或第三代測序。例如2009年，Pacific Biosciences公司研發了SMRT；2012年，英國牛津納米孔技術（ONT）公司開發出了納米孔單分子測序技術。與前兩代相比，第三代測序技術最大的特點就是單分子測序，測序過程無需進行PCR擴增。但限于目前的技術與材料的發展，第三代測序技術沒有如NGS成熟，存在一定的缺陷。例如，SMRT的錯誤率在13%~15%左右。從過去到現在，再到將來，生物技術在不斷進步，而人類對生命的探究永不停歇。
將待測DNA樣品被打斷成300-800bp的片段后，3' 和5'端分別加上接頭，這些接頭會使DNA片段結合到微珠上。測序PCR反應就發生在固相的微珠上，并且整個PCR反應和相關的酶被油包水的液滴包裹，每個油滴系統只包含1個DNA模板。擴增后，每個DNA分子可以得到富集，每個微珠只能形成一個克隆集落。454測序儀的測序通道體積非常狹小，只能容納一個微珠。測序過程中，GS FLX系統會將引物上dNTP的聚合與熒光信號釋放偶聯起來。通過檢測熒光信號，就可以達到DNA測序的目的。對比其他兩個廠商，讀長上具有明顯優勢，使得后續的拼接工作更加高效和準確。但是由于使用的是焦磷酸測序原理，對瞬時發光進行檢測，限制了其更大的通量，并且對于同聚物的檢測不夠準確。除此之外，和其他高通量測序平臺相比，其測序成本要高得多，在激烈的市場競爭中，并沒有發揮出先行優勢。- 2013年，Roche公司宣布正式關閉454測序業務。
Illumina的Solexa的測序原理是可逆終止化學反應；DNA片段加上接頭之后，可以隨機的附著于玻璃表面（Flow cell），并且在固相的表面經過橋式擴增。這樣就形成了數千份相同的單分子簇，被用做測序模板。測序采取邊合成邊測序（SBS）的方法，每次只復制一個堿基，和模板配對的ddNTP原料被添加上去，不配對的ddNTP原料被洗去，成像系統能夠捕捉熒光標記的核苷酸。隨著DNA 3'端的阻斷劑的去除，下一輪的延伸就可以進行。和焦磷酸測序不同，每次DNA的只能延伸一個核苷酸。Solexa的讀長在100-150bp之間，適合小RNA鑒定、甲基化和表觀遺傳學研究。
由于Solexa技術在合成過程中每次只能添加一個dNTP，因此很好地解決了同聚物測定的準確性問題。ABI Solid技術的核心是4種熒光標記寡核苷酸的連接反應測序。測序之前，DNA模板通過乳化PCR擴增，和Roche 454的基本相同，只是Solid的微珠更小，只有1μm。3'端修飾的微珠可以沉淀在玻片上。連接測序所用的底物是8個堿基熒光探針混合物，根據序列的位置，樣品DNA就可以被探針標記。DNA連接酶優先連接和模板配對的探針，并引發該位點的熒光信號的產生。Solid的讀長只有25-75bp，精確度可達Q40，適于基因組重測序和SNP檢測。Solid技術最大讀長只能達到75bp，使得其在基因組拼接和結構變異研究中的可操作性大大降低。在熒光解碼階段，鑒于其是雙堿基確定一個熒光信號，因而一旦發生錯誤就容易產生連鎖的解碼錯誤。除此之外，Solid技術還受制于工業生產，最終在第二代測序平臺的激烈競爭中退出了歷史舞臺。
第一代測序技術具有長讀長（1000bp）和準確率高（99.999%）的優勢，但同時具有測序成本高、耗時久、通量低等缺點，因而不能滿足深度測序和重復測序等大規模基因組測序的需求。
而NGS最顯著的特點在于高通量，同時測序成本相對第一代測序技術大大降低的特點，但其讀長比第一代短，并具有因PCR的偏向性而導致的系統錯誤。未來的測序技術一定會向著更高通量、更廉價也更精準的方向前進。
